Мультимодальная регистрация изображений и анализ связности для интеграции коннектомных данных микроскопии в МРТ

Ниже мы описываем животных и их манипуляции; визуализация in vivo и ex vivo; Окрашивание CLARITY и микроскопия; ЗАХВАТАЙТЕ вирусную маркировку; Обработка изображений МРТ, КТ и микроскопии; регистрация и сегментация; статистический анализ; извлечение признаков на основе подключения, трактографии dMRI и трактографии CLARITY-STA; и, наконец, анализ терминала волокна.

Животные и материалы

Все эксперименты проводились в соответствии с законами об уходе за животными и институциональными руководящими принципами, одобренными Стэнфордским институциональным комитетом по уходу и использованию животных, и в соответствии с руководящими принципами NIH. Мы использовали n = 10 Thy1-YFP (линия-H) мышей в возрасте 8–10 недель (B6.Cg-Tg (Thy1-YFP) 15Jrs / JC57BL / 6J, Jackson Laboratory) и n = 10 диких мышей. тип однопометников в контрольной группе. Всем мышам была проведена визуализация Thy1-YFP на световом листе.Три из 10 контрольных мышей подверглись in vivo МРТ и окрашиванию ИП. Мышей содержали при цикле свет: темнота 12:12 ч с доступом к пище и воде ad libitum.

Transient MCAO

Мышей во время операции держали под наркозом с помощью 2–3% изофлурана в воздухе. Температуру тела, частоту сердечных сокращений и дыхание контролировали каждые 15 минут и поддерживали в физиологическом диапазоне. Была обнажена область общей сонной артерии, и покрытая силиконовой резиной нить размером 7–0 (Doccol Corporation, Шарон, Массачусетс, США) была введена через левую внутреннюю сонную артерию до приблизительной ветви левой средней мозговой артерии и оставлена ​​в ней. место на 30 мин, чтобы заблокировать кровоток.Впоследствии шов был удален, чтобы обеспечить реперфузию, и зашили раны. Чтобы обеспечить восстановление после операции, мышам подкожно вводили 0,01 мг / кг бупренорфина и 0,9% физиологический раствор. Через 24 часа подкожно вводили физиологический раствор (25 мкл / г массы тела), чтобы предотвратить обезвоживание из-за снижения подвижности.

In vivo MRI

Через 24 часа после MCAO мышей сканировали на 7-Т животном MRI-сканере (Agilent Technologies / Bruker) с использованием многоножечной катушки. Животных анестезировали 2% изофлураном на воздухе и фиксировали на люльке для иммобилизации головы.Температуру тела поддерживали на уровне 37 ° C с использованием постоянного потока воздуха, а концентрацию анестетика регулировали в зависимости от частоты дыхания.

T2-взвешенная последовательность FSE (быстрое спин-эхо) с временем эхо / временем повторения (TE / TR) = 40/2500, толщиной среза = 0,5 мм и разрешением в плоскости 0,1172 × 0,1172 мм, чтобы получить структурное изображение головного мозга в высоком разрешении. Карта T2 была получена с использованием последовательности 2D SE (спин-эхо) с TE = 12,1 мс, 24,3 мс, 36,4 мс, 48,5 мс, TR = 3500 мс, толщина среза = 1 мм, 0.Зазоры между срезами 5 мм, разрешение в плоскости 0,078 × 0,078 мм. Значения T2 были подобраны с использованием собственного скрипта Matlab (MathWorks, Inc.). Сохраняя ту же геометрию, карта T1 была получена с помощью последовательности FSE-IR (быстрое спиновое эхо с восстановлением инверсии), TE / TR = 7,2 / 5000, и время инверсии = 200, 400, 800, 1600, 3200 мс. Значения T1 были подобраны с использованием сценария Matlab ⁵⁴ . Прокладка высшего порядка (третья) была выполнена для оптимизации однородности магнитного поля, чтобы минимизировать артефакты изображения для сканирования dMRI.Сканирование dMRI состояло из последовательности EPI (эхо-планарной визуализации) с градиентами биполярной диффузии, TE / TR = 16,3 / 1200, 4 средних, 0,1172 × 0,1172 мм разрешение в плоскости, толщина среза 1 мм, зазор 5 мм между соседними срезами, 3 b = 0 изображений и 18 линейно независимых направлений диффузии с b = 1000 с / мм ² .

Ex vivo CT

КТ с высоким разрешением ex vivo с контрастным усилением была получена для всех мышей после погружения в йодсодержащий контрастный агент (Omnipaque ^® , GE-HealthCare) на микро-CT сканере MicroCAT II (Siemens Preclinical Solutions), используя следующие параметры: напряжение рентгеновского излучения 48 кВ и анодный ток 200 мкА, а также 0.Шаг поворота 6 ° на протяжении 198 °, с результирующим размером изотропного вокселя 18 мкм.

Ex vivo МРТ высокого разрешения

Структурное и диффузионное МРТ высокого разрешения ex vivo было выполнено иссеченного мозга контрольной мыши (не входившей в предыдущую контрольную когорту). Структурное сканирование представляло собой T1-взвешенную последовательность FLASH (быстрый выстрел под малым углом) с TE / TR = 20 / 42,9, 8 средними значениями и изотропным разрешением 100 мкм. Диффузионное сканирование имело TE / TR = 28,8 / 500 мс, изотропное разрешение 200 мкм, 70 b = 0 сканирований, 150 направлений с b = 1000 с / мм ² , 230 направлений с b = 2000 с / мм ² , 270 направлений с b = 4000 с / мм ² и 350 направлений с b = 8000 с / мм ² .

Очистка тканей

CLARITY была выполнена, как описано ранее ^15,28 . Вкратце, мозг, связанный с параформальдегидом (PFA), переносили в раствор мономера CLARITY, состоящий из 1% акриламида, 0,125% бисакриламида, 4% PFA и 0,025% инициатора VA-044 в 1-кратном фосфатно-солевом буфере (PBS) для 3 дня при 4 ° C, полимеризовался дегазированием и инкубированием при 37 ° C в течение 3-4 часов и пассивно очищался в 4% додецилсульфате натрия в течение 3 недель при 37 ° C в 50-мл пробирке Falcon.Затем образцы промывали PBS + 0,1% Triton-X (PBST) в течение 2–3 дней и помещали в RapiClear (SunJin Labs) за 12 часов до визуализации.

Окрашивание и микроскопия

Визуализация светового листа : Изображения всего мозга получали с помощью ультрамикроскопа II (Lavision Biotec). Образцы закрепляли на изготовленном на заказ держателе, напечатанном на 3D-принтере, с помощью крепежного геля RapiClear (SunJin Lab). Они были надежно закреплены на держателе после затвердевания монтажного геля (~ 5 мин при 4 ° C). Установленные образцы визуализировали внутри камеры для визуализации, заполненной 150 мл RapiClear (можно использовать повторно путем периодической фильтрации).Образцы оставляли в камере для визуализации на 20–40 мин перед визуализацией, чтобы обеспечить равновесие раствора для визуализации. Мозг получали с помощью объектива с числовой апертурой × 2 / 0,5 при увеличении × 0,6. Создание многоцветных изображений стало возможным благодаря установке фильтров на суперконтинуумный белый лазер (фотоника NKT). Образцы визуализировались двумя световыми листами (NA = 0,144), освещенными с обеих сторон образца. Z -шаг был установлен на 5,16 мкм (при увеличении × 0,6). Для каждой плоскости изображения были установлены пять горизонтальных фокусных точек для создания однородного поля зрения.После визуализации образцы возвращали в PBST и делали срезы примерно на 2–3 мм для конфокальной визуализации с помощью лезвия бритвы.

Конфокальная визуализация : Очищенные ткани (коронковые срезы 2–3 мм) инкубировали в растворе PI (Cell Signaling Technologies) в течение 2–3 дней, возвращали в PBST, инкубировали в RapiClear CS в течение 1 дня и устанавливали с помощью Wilco блюдо. Затем ткани визуализировали с помощью системы Olympus FV1200, оснащенной водно-иммерсионным объективом × 10 (числовая апертура: 0.6; рабочее расстояние: 3 мм; размер шага 5 мкм).

CAPTURE labeling

Очистка тканей и визуализация световых листов всего полушария выполнялись, как описано в разделе «Очистка тканей». Мечение аксонов вируса проводили согласно методу CAPTURE ²⁸ . Вкратце, n = 3 мыши C57BL / 6 дикого типа (от JAX) инъецировали 1 мкл AAV8-CaMKIIa-EYFP-NRN в области PL внутри правого mPFC (AP = 2,0, L = 0,3, V = 2,5 мм). После инъекции мышей возвращали в их домашние клетки на 4 недели, чтобы обеспечить полную экспрессию флуорофоров.Для световой микроскопии все необработанные изображения были получены в виде 16-битных файлов TIFF. Необработанные изображения были дополнительно обработаны слепой трехмерной деконволюцией с использованием AutoQuantX3 (Media Cybernetics) перед STA.

Регистрация изображения ЯСНОСТЬ всего мозга в ARA

Цель процедуры регистрации — обеспечить бесшовное сопоставление между МРТ / КТ, ЯСНОСТЬЮ и ARA. Это было достигнуто путем вычисления для всего мозга преобразований ЯСНОСТЬ в ARA (ЯСНОСТЬ-ARA) и преобразований МРТ в ARA (MRI-ARA). В CLARITY окрашивание участков объемов CLARITY регистрировалось в CLARITY всего мозга, а затем легко в ARA.Точно так же с МРТ все МРТ-изображения были зарегистрированы в Т2-взвешенные изображения всего мозга, которые сами были зарегистрированы в ARA.

Для выполнения точного сопоставления между CLARITY и ARA мы разработали специализированные рабочие процессы, оптимизированные для мультимодальной регистрации уточненных данных, на основе инструментов из ANT ³³ (http://stnava.github.io/ANTs/) . Рабочие процессы включали предварительную обработку, извлечение мозга, коррекцию интенсивности, оценку ориентации и инициализацию регистрации, а также оптимизированные показатели сходства и параметры оптимизации и регуляризации для многоэтапных регистраций с несколькими разрешениями.Ниже описаны протоколы предварительной обработки и регистрации шаблонов CLARITY для ARA всего мозга.

Чтобы облегчить нелинейную регистрацию ЯСНОСТИ в пространстве ARA, был получен канал автофлуоресценции, который обеспечивает подробную анатомическую информацию и достаточный контраст, а также четкий контур мозга (рис. 2а). Полученные матрицы преобразования и поля деформации были затем применены к оставшимся каналам CLARITY (рис. 2b). Данные tiff канала автофлуоресценции CLARITY (594 нм) сначала были преобразованы в объем изображения формата nifti.Во время преобразования данные CLARITY были уменьшены в 5 раз. Затем входное изображение было скорректировано по интенсивности с использованием непараметрического алгоритма коррекции поля смещения N4 ⁵⁵ для устранения неоднородностей (неоднородностей) и артефактов затенения. Затем мы сгладили изображение с помощью медианного фильтра с радиусом в три вокселя. Набор данных также был замаскирован с использованием серии пороговых значений, эрозии, анализа связанных компонентов и шагов расширения, чтобы удалить любые контуры, полученные во время микроскопии, не относящиеся к мозгу.Наконец, обработанное входное изображение было ориентировано на «стандартную» ориентацию, соответствующую шаблону ARA, чтобы максимизировать сходство между двумя объемами.

Регистрация изображения между объемом автофлуоресценции CLARITY и шаблоном ARA основывалась на выравнивании на основе интенсивности. Шаблон ARA 25 мкм был выбран в качестве эталонного изображения для этапов регистрации, а метки ARA 25 мкм были впоследствии деформированы и преобразованы в исходное пространство с полным разрешением CLARITY. Параметры регистрации были выбраны после тестирования большого пространства параметров и качественной оценки точности совмещения для нескольких наборов данных путем визуальной проверки наложенных изображений с использованием одних и тех же параметров для всего мозга мыши.Для визуализации результатов регистрации мы построили справочные таблицы (LUT) для использования с открытым исходным кодом ITKsnap (http://www.itksnap.org) и Freeview (Freesurfer) (https: //surfer.nmr .mgh.harvard.edu), чтобы информация о зарегистрированной метке (имя и идентификатор) отображалась там, где пользователь интерактивно перемещает курсор (дополнительный рисунок 1d). Первым этапом регистрации было начальное выравнивание с использованием инструмента antsAffineInitializer из ANT ³³ с коэффициентом поиска 1 градус (приращения поиска), поиском вокруг главной оси 1 радиан и локальной оптимизацией 500 итерации выполняются в каждой точке поиска.Второй этап регистрации состоял из b-сплайна на основе интенсивности, трехэтапной регистрации с увеличивающимися степенями свободы их преобразований, охватывающих (а) жесткие 6 степеней свободы (DOF), (b) аффинные (12 DOF) и (c) нежесткий (деформируемый) этап b -сплайновой симметричной нормализации (SyN), каждый из которых состоит из подхода с несколькими разрешениями и 4 уровнями. Мы использовали метрику подобия взаимной информации (MI) для жесткого и аффинного этапов, используя сплайн-расстояние 26, 32 бина для выборки гистограммы, допуск сходимости 1e-10 и гауссову регуляризацию полей деформации.Мы использовали взаимную корреляцию (CC) для деформируемого предметного столика ⁵⁶ с радиусом 2 мм и длиной шага градиента 0,1. Чистым продуктом регистрации является преобразование, которое выполняет двунаправленное преобразование изображений в собственное пространство CLARITY и обратно, в шаблоны и метки ARA и обратно.

Регистрация секций CLARITY

Чтобы зарегистрировать секции CLARITY размером 2–3 мм (которые составляют примерно четверть всего мозга) в шаблоне ARA, мы сначала зарегистрировали канал YFP каждой секции в YFP всего мозга, а затем использовал искажение всего мозга до ARA.Мы разработали алгоритм рекурсивного поиска для поиска в объеме CLARITY с использованием пирамидального подхода и нахождения сегмента, который лучше всего соответствует желаемому входному разделу. В частности, изображение всего мозга было разрезано на несколько сегментов (на основе размера входной секции), и среднеквадратичная разница была вычислена как мера сходства между каждым из этих извлеченных в цифровом виде сегментов и входной вырезанной частью. Затем было выполнено пять раундов рекурсивного поиска, в которых различные сегменты были извлечены вокруг начального сегмента с наибольшим сходством.Извлечение производилось с помощью скользящего окна с убывающими приращениями. Последний извлеченный сегмент с наибольшим сходством с разрезом был установлен на 15% больше, чем разрез, чтобы учесть ошибки совпадения на границах разреза. Затем была проведена стандартная регистрация сплайна b с жестким, аффинным и деформируемым этапами с использованием согласованного сегмента в качестве эталонного изображения. За этим последовало преобразование секций CLARITY (YFP и PI) в шаблон ARA с использованием полей деформации от части к целому, а также от CLARITY к полям деформации ARA.Передискретизация была выполнена за один шаг путем объединения всех соответствующих полей преобразований и деформаций.

Регистрация изображений in vivo и ex vivo в ARA

Все последовательности МРТ in vivo были зарегистрированы с использованием аффинного преобразования для структурного T2-взвешенного сканирования (разрешение 0,1172 × 0,1172 × 0,5 мм) для учета любого движения во время сканирования сеанс. Эталонную Т2-взвешенную последовательность, в свою очередь, регистрировали на 25 мкм матрице ARA для деформации всех количественных карт в пространстве ARA.Аналогичный протокол предварительной обработки и регистрации для CLARITY-ARA (описанный в предыдущем разделе) использовался для картирования МРТ. Основные отличия включали этап удаления черепа для МРТ, исключение начального этапа регистрации antsAffineInitializer (из-за улучшенного соответствия статистики гистограммы), меньшее количество интервалов гистограммы (8) для ИМ на жестком этапе и использование метрики сходства CC на этапе аффинной регистрации. Кроме того, радиус 8 использовался для CC в симметричном деформируемом предметном столике b с несколькими разрешениями.Все карты МРТ in vivo были совместно зарегистрированы в структурном объеме МРТ с самым высоким разрешением (в данном случае, Т2-взвешенная последовательность) и преобразованы в пространство ARA с использованием полей деформации между матрицей ARA 25 мкм и структурными данными МРТ (рис. 2в). Те же шаги были использованы для регистрации наших данных КТ ex vivo.

Сегментация и извлечение признаков

Мы разработали протоколы трехмерной сегментации для обоих типов данных (каналов), которые мы получили: протокол разреженной нейрональной сегментации для YFP и ядерная версия для PI.Протоколы сегментации были реализованы как макросы Fiji ( ImageJ , https://fiji.sc) и включали три основных этапа: предварительную обработку изображения для выделения функций, простую трехмерную сегментацию для создания начальных маркеров и маркер водораздела. -управляемая сегментация для получения окончательных высококачественных сегментированных изображений. Предварительная обработка включала удаление фона с использованием поворота радиуса 50, нормализацию гистограммы к первому срезу стека для устранения неоднородности интенсивности по срезам, повышение контрастности, медианную 3D-фильтрацию для удаления шума с радиусом 2 пикселя ³⁴ , вычисление локального порога с использованием метода Phansalkar с радиусом 15 пикселей и, наконец, вычисление трехмерных локальных минимумов с использованием радиуса 2 пикселя.Затем мы вычислили простую трехмерную сегментацию с пороговой обработкой для фильтрации больших объектов, как это реализовано в 3D Image Suite ³⁴ . Впоследствии была использована управляемая маркером сегментация 3D Watershed, реализованная в Morphological Suite ³⁵ . Алгоритм имитирует наводнение от входных маркеров путем преобразования входного изображения в топологическую поверхность. Среднее отфильтрованное изображение использовалось в качестве входного изображения, сегментация локальных минимумов — в качестве маркеров, а локальный порог — в качестве изображения маски.Протокол сегментации был реализован таким образом, что его результаты не сильно зависят от входных параметров, таких как радиусы фильтрации. Настройка параметров для удаления фона, локального порогового значения и фильтрации была выполнена путем визуального осмотра исходных изображений и сегментированных ячеек. Для канала PI аналогичный протокол использовался для сегментации без медианной фильтрации из-за гораздо более высокой плотности клеток.

Чтобы суммировать наши результаты сегментации в пространстве ARA и сгенерировать тепловые карты CLARITY для корреляции МРТ, был использован метод понижающей дискретизации, чтобы преобразовать наши результаты сегментации с полным разрешением в пространство с разрешением 25 мкм.Объемы сегментации (сегментированные с несколькими метками клетки или ядра) сначала были свернуты с помощью сферического ядра с радиусом 5 мкм (с областью, представляющей воксель в пространстве ARA). Затем количество меток (ячеек или ядер) в каждой свернутой сфере усредняется как воксель на вокселизированной карте. Извлечение признаков было выполнено на вокселизированной карте в 3D и суммировано по регионам / меткам ARA. Подсчитывали количество клеток, плотность клеток и объемную статистику красителей CLARITY. Извлечение свойств региона было выполнено в Python с использованием модуля skimage ; Для параллельных вычислений использовались joblib и multiprocessing модули.Извлечение параметров выполнялось также для методов визуализации, в частности, диффузионной и релаксометрической МРТ in vivo и КТ ex vivo, усредненных в пределах искаженных меток ARA в естественном пространстве МРТ и КТ.

Проверка регистрации и сегментации

Для проверки точности наших протоколов регистрации CLARITY-ARA и MRI-ARA ориентиры были вручную нанесены на анатомические области одним автором (дополнительный рис. 1b). Ориентиры были размещены на родных томах всех модальностей до любых преобразований.Эти ориентиры были выбраны таким образом, чтобы они были четко видны на обеих модальностях и чтобы они были хорошо распределены в объеме (дополнительный рис. 1b, c). В среднем 30 ориентиров было нанесено на объем для всех десяти мышей в когорте. Затем ориентиры были преобразованы с использованием полей преобразований и деформаций, вычисленных во время регистрации. TRE вычисляли путем усреднения среднеквадратичной ошибки между наборами деформированных ориентиров для всех мышей (дополнительный рис. 1b, c).Размещение ориентира и вычисление TRE были выполнены в 3D Slicer (https://www.slicer.org). Для дальнейшего тестирования нашего конвейера мы использовали наш протокол регистрации для очень зашумленного набора данных CLARITY и объемов с большой неоднородностью интенсивности. Алгоритм по-прежнему обеспечивает адекватную точность при визуальной оценке (дополнительный рис. 1a). Мы также протестировали наш протокол регистрации на различных наборах данных, не включенных в нашу когорту исследования, и обнаружили, что он обеспечивает очень точное согласование (дополнительный рис.1а). Для подтверждения сегментации специфичность определялась процентом правильно обнаруженных ячеек: истинно положительные / (истинно положительные + ложноположительные), а степень обнаружения определялась как процент обнаруженных достоверно достоверных ячеек: истинно положительные / (истинно положительные + ложноотрицательные) . Числа представляли собой средние значения трех независимых подсчетов в областях коры контрольных мышей Thy1-YFP (дополнительный рис. 4c).

Статистический анализ

Тепловые карты всех параметров изображения и функций ЯСНОСТИ были созданы путем вычисления суммы квадратов всех зарегистрированных изображений (мышей) для каждой модальности в пространстве ARA.Для оценки эффектов внутри модальности парные тесты Стьюдента t (двусторонние) были выполнены между ипсилатеральным и контралатеральным полушариями каждой модальности и внутри каждой метки ARA у всех мышей, перенесших инсульт. Для визуализации результатов цвет (значение интенсивности) каждой метки ARA представлял значение p соответствующего теста t , чтобы отразить значимость разницы между полушариями внутри метки для конкретной модальности (рис. 2c). Для оценки мультимодальных корреляций между визуализацией и ЧЕТКОСТЬЮ были выполнены воксельные ранговые корреляции Спирмена между тепловой картой количества PI-клеток и параметрами визуализации по всем вокселям в объеме визуализации (рис.2г). Для корреляции CT – PI мы нормализовали по контралатеральной стороне и исключили желудочки с очень плотным йодсодержащим контрастом. Аналогичным образом были выполнены воксельные корреляции Спирмена для оценки соответствия между трактографией CSD и картами сегментированных проекций сигнала из вирусной трассировки CLARITY и атласа связности Аллена эфферентных проекций mPFC (рис. 3, дополнительный рис. 12a, b). Карты были сглажены перед регистрацией с использованием гауссова ядра со стандартным отклонением в один воксель для учета ошибок регистрации.Никаких дополнительных репликаций данных не производилось. Статистический анализ был выполнен в Python (v. 2.7) с использованием модулей scipy , statsmodels, и scikit-learn .

Анализ связности

Мы стремились определить области, связанные с тканью, пораженной инсультом, чтобы начать исследование сетевых эффектов инфаркта. Области мазка сначала были вручную очерчены для всех мышей на наших изображениях с самым высоким разрешением, изображениях, взвешенных in vivo по T2, которые четко очерчивают штрих в этот 24-часовой момент времени.Затем сегментированные маски были преобразованы с использованием интерполяции ближайшего соседа в пространство ARA с использованием полей деформации из нашей регистрации MRI-ARA. Чтобы вычислить карты частоты инсультов, которые количественно определяют количество раз, когда воксель ARA очерчивается как штрих, деформированные маски были преобразованы в двоичную форму и сложены в пространстве ARA. Маска штрихов с наибольшим кортико-полосатым перекрытием (пунктирный черный контур на рис. 4b) была выбрана в качестве области интереса для анализа связности. Все метки ARA в выбранной маске были извлечены и отсортированы по объему.Для анализа, представленного на рисунках, мы ограничили визуализацию 50 крупнейшими метками в пределах ROI. Затем был осуществлен поиск, чтобы проверить, проводился ли эксперимент с инъекцией в атласе связности Аллена ¹¹ с каждой из 50 меток в качестве места инъекции. Штамм дикого типа (C57BL / 6J) был выбран для ограничения поиска. Для каждой метки без эксперимента с инъекцией проводился поиск ее родительских меток до тех пор, пока не был найден эксперимент с инъекцией. Затем был выполнен запрос с использованием API подключения Allen Brain Institute (http: // help.brain-map.org) для извлечения информации о структурных связях для каждого места инъекции. Структурная связность была отсортирована по нормализованному объему проекции (объем проекции, нормализованный по объему в структуре закачки) в целевой структуре от закачки. Чтобы сосредоточиться на более подробных структурах среднего уровня онтологии, мы исключили основные метки с глубиной графа онтологии <5 и порядком графа <6. Дочерние метки места инъекции были удалены из целевого списка. Чтобы суммировать связность области удара, была рассчитана карта плотности проекции с данными для каждого места инъекции (метки), представленными в виде строки, и уменьшением связности целевых структур за счет нормализованного объема проекции слева направо (рис.3б, центральная панель). Наконец, для выявления сетей и тенденций связности в области инсульта мы вычислили наиболее распространенные цели из 50 меток и сгенерировали матрицу связности, а также коннектограмму мест инъекций в ишемическом поражении и их общих мишеней (рис. Рис.8).

Клеточная дегенерация по дереву связности

Чтобы оценить клеточную дегенерацию в удаленных областях до области инсульта, вычисленные плотности клеток для мышей, перенесших инсульт (с использованием родительских меток атласа Аллена), были сначала нормализованы по отношению к средней плотности клеток контрольные мыши (на этикетке).Была вычислена обратная величина, и эта обратная величина была наложена на метки ARA с увеличением непрозрачности меток ARA, соответствующих уменьшению плотности клеток (рис. 3a — правая панель). После вычисления анализа связности и карты плотности проекции области удара мы хотели определить взаимосвязь между клеточной дегенерацией и связностью вдали от ишемического ядра. Мы использовали информацию о связности ROI удара, извлеченную в предыдущем разделе, и для каждой целевой структуры каждого места инъекции (метки) мы вычислили ее нормализованную плотность клеток (нормализованную контрольными мышами).Затем мы разделили ипсилатеральные мишени (и их плотности клеток), представленные синими полосами на рис. 4b и дополнительном рис. 5а. Для ипсилатеральных структур рассчитывалась средняя плотность клеток, и каждая структура с плотностью клеток ниже двух стандартных отклонений от среднего была выделена (столбики лососевого цвета). Каждая из целевых структур с более низкой плотностью клеток была автоматически идентифицирована из графа онтологии ARA, чтобы выделить удаленные области с повышенной клеточной дегенерацией, которые тесно связаны с ишемическим поражением.Для дальнейшего изучения клеточной дегенерации в связанных мишенях за пределами области инсульта мы выполнили дополнительный анализ, в который были включены только мыши с инсультами, равными или меньшими (по объему) 50% -ной карте заболеваемости. Целевые структуры с перекрытием с маской штрихов любой мыши были исключены. Подобно предыдущему анализу, графики нормализованной плотности клеток были рассчитаны для целей (за пределами маски штрихов), связанных с областями в маске штрихов (дополнительный рис. 5b).

Гистологическая проверка

Мышей умерщвляли на 15-й постнатальный день и перфузировали транскардиально ледяным PBS с последующим введением 3% PFA. Мозг удаляли и подвергали криозащите в течение ночи в растворе 20% сахарозы / 3% PFA. После того, как мозги опустились на дно, их замораживали на сухом льду и хранили при -80 ° C до разделения. Срезы толщиной 30 микрометров вырезали с помощью криостата и хранили при -20 ° C в растворе антифриза (30% этиленгликоля и 30% глицерина в PBS). Для окрашивания двумя первичными антителами срезы обрабатывали в соответствии со следующими этапами: сначала промывали в PBS, затем инкубировали с предварительно нагретым 0.1 М цитрат натрия при 60 ° C в течение 20 минут для поиска антигена. После этого срезы переносили в блокирующий раствор (10% нормальная сыворотка животных, 1% бычий сывороточный альбумин в 0,3% PBS-тритоне X) в течение 1 ч и инкубировали в растворе первичных антител к CD68 (1: 500, Abcam ab53444). ) и MAP2 (1: 200, D5G1, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), разбавленный в блокирующем растворе в течение ночи при 4 ° C. На следующий день срезы промывали 0,3% PBS-тритоном X и инкубировали со вторичными антителами (1: 500, Alexa fluor 546, Invitrogen A11081 для CD68; и 1: 500, Alexa fluor 488, Invitrogen A32731 для MAP2), разведенными в блокирующий раствор при комнатной температуре в течение 2 ч.DAPI (1: 2000) добавляли в течение последних 5 минут инкубации вторичных антител. Затем срезы промывали PBS, монтировали и закрывали покровным стеклом. Область поражения инфаркта идентифицировали по CD68-положительным активированным моноцитам / макрофагам. Мы подтвердили, что CD68-положительные области соответствуют MAP2-отрицательным областям (потеря нейронов) (дополнительный рис. 6a). Изображения были получены с помощью камеры CCD при увеличении × 10 (AxioCam MRm; Carl Zeiss AB, Швейцария), Axio Imager M2 (Carl Zeiss AB, Швейцария) и программного обеспечения MBF Neurolucida (MBF Bioscience, Уиллистон, VT, США).Количественный анализ инсульта был проведен на коронарных срезах на уровне таламо-гиппокампа (диапазон: от 1,3 мм до 2,1 мм кзади от Bregma). Для совмещения исходного гистологического изображения и ARA было выбрано соответствующее изображение ARA 25 мкм и вручную масштабировано до размеров гистологии в пикселях. Регистрация двухмерных изображений на основе ориентиров выполнялась в 3D Slicer (v4.6.2, http://www.slicer.org) с использованием алгоритма сплайна тонких пластин, модифицированного Ito et al. ⁵⁷ . Набор из 20–30 ориентиров (реперных точек) был помещен на движущееся (ARA) и фиксированное (гистологическое) изображение для обеспечения точной регистрации (дополнительный рис.6б). Полученное преобразование было применено к шаблону ARA и меткам. Зарегистрированные изображения (ARA, метки ARA, каналы микроскопии) были объединены в стопку в ImageJ (v1.5k, https://imagej.nih.gov/ij/). Маска поражения, определенная вручную, нарисованная с использованием доступных красителей для определения пораженных инсультом областей ARA для каждой мыши (дополнительный рис. 6c). Экспрессия MAP2 была количественно определена в зарегистрированных областях ARA из гистологических срезов, и был проведен парный тест t (между ипсилатеральным и контралатеральным полушариями) для верхних 15 регионов с низким ипсилатеральным MAP2 в когорте (дополнительный рис.7б). Афферентная связность для регионов со значительно более низким MAP2 ипсилатерально была автоматически извлечена из атласа связности Аллена. Вкратце, запрос был выполнен с использованием API подключения Allen Brain Institute (http://help.brain-map.org) для извлечения информации о афферентных структурных связях для каждого идентифицированного региона из гистологии (регионы были определены как «целевые» структуры в связности поиск). Структурная связность была отсортирована по нормализованному объему проекции (объем проекции, нормализованный по объему в структуре закачки) в целевой структуре от закачки.Чтобы сосредоточиться на более подробных структурах среднего уровня онтологии, мы исключили основные метки с глубиной графа онтологии <5 и порядком графа <6. Мы сосредоточились на афферентной связности с пятью основными регионами, выделив большие проекции от областей инсульта (в частности, от CP и CA1) (дополнительный рис. 7d). Эти проекции (исходящие от CP и CA1) и идентифицированные целевые области из гистологии были визуализированы (визуализированы) в программном обеспечении Brain Explorer (https://mouse.brain-map.org/static/brainexplorer).

Анализ тензора трехмерной структуры

Мы адаптировали классический метод анализа текстуры, называемый STA, из 2D в 3D, чтобы восстанавливать локальные ориентации волокон и восстанавливать вычислительные модели траекторий пучков волокон по градиентам интенсивности изображения ²⁸ (http: // capture- clearity. 2} \ end {array}} \ right] $$

(2)

, где I _x , I _y и I _z — градиенты объемов изображений I вдоль каждого из x , x , , и оси z (маркер краев трактов волокна), вычисленные путем свертки I с тремя трехмерными производными первого порядка гауссовых фильтров со стандартным отклонением σ _dog ⁶¹ .Параметры σ _g и σ _dog необходимо отрегулировать соответствующим образом на основе отношения сигнал / шум и разрешения изображения для изображений CLARITY. Структурные тензоры вычислялись с использованием Matlab (MathWorks, Inc.).

Затем был использован детерминированный трактографический алгоритм FACT ⁵⁰ для распространения линий тока из «исходной» области через восстановленное векторное поле вокселов-зависимых ориентаций волокон, полученных с помощью STA, и завершается, если линия тока делает резкий поворот (углы больше, чем заданный порог α _порог = 35 °) или выходит за пределы замаскированной области мозга.В областях с низким флуоресцентным окрашиванием ориентация структура-тензор становится зашумленной, что приводит к резким поворотам линий тока и отсечке линии тока через наш порог, таким образом, угловой порог эффективно служит аналогом порога FA для трактографии DTI, чтобы прекратить рационализировать.

Анализ на уровне тракта

Чтобы оценить влияние инсульта на ЯСНОСТЬ на уровне тракта, все данные Thy1-YFP всего мозга (девять инсультов и девять контрольных мышей) были преобразованы в пространство dMRI ex vivo (с использованием комбинированного картирования к пространству Аллена и МРТ ex vivo).Сначала мы преобразовали все данные Thy1-YFP всего мозга (инсульт и контрольные мыши) в пространство dMRI. Объемы Thy1-YFP (как для инсульта, так и для контроля) были перевернуты влево-вправо и снова деформированы с использованием тех же деформаций, чтобы оценить различия полушарий с теми же участками волокон. Снова засевая область PL, мы использовали алгоритм вероятностной трактографии iFOD2 для отслеживания двух путей: (1) линии тока mPFC к VTA, пересекающие CP и присоединение к CST, и (2) линии тока mPFC к RSP, присоединение к пучку cingulum .Параметры отслеживания были одинаковыми для обоих участков, с порогом распределения ориентации волокна 0,2 (FOD), порогом угла 35 ° и максимальным количеством 5000 линий тока. Значения Thy1-YFP отбирались вдоль двух трактов для обеих групп (инсульт и контроль) и обоих полушарий (с перевернутыми изображениями влево-вправо, используемыми для вычисления профилей контралатерального тракта). Профили трактов были созданы путем усреднения значений для каждых десяти смежных линий тока для мыши (и полушария). Среднее абсолютное процентное различие Thy1-YFP между полушариями было вычислено для каждой группы (инсульт и контрольная), и был проведен двухвыборочный тест Стьюдента t для оценки значимости между группами для каждого тракта.

Аналогичный анализ на уровне трактов был проведен с использованием трактов на основе STA от вирусной инъекции, оптимизированной для CLARITY (описанной в разделе «Мечение CAPTURE»). Данные Thy1-YFP всего мозга (инсульт и контрольные мыши) были зарегистрированы и преобразованы в пространство ЯСНОСТЬ. Их также переворачивали влево-вправо и снова деформировали, используя те же деформации, чтобы оценить различия полушарий с теми же участками волокон. Затем мы извлекли линии тока mPFC в VTA, пересекая CP и присоединяясь к CST, используя STA и засевая в области PL (как описано в разделе «Анализ тензора трехмерной структуры»).Подобно анализу dMRI на уровне тракта, профили тракта были рассчитаны для линий тока STA, и был проведен двухвыборочный тест Стьюдента t для оценки значимости между средними процентными различиями Thy1-YFP обоих полушарий для обеих групп (инсульт и контроль). .

Анализ проекционного терминала

После выполнения реконструкции волокна с помощью STA очищенных данных вирусной инъекции были сгенерированы карты терминалов трактов (конечных точек) путем вычисления количества концевых трактов на воксел.Выражение вирусного индикатора указывает на полную протяженность путей в 3D, а интенсивность сигнала уменьшается на концах проекций, что может быть зафиксировано с помощью вычислений. Алгоритм трактографии (аналог трактографии на основе dMRI) ²³ использовался для соединения этих локальных ориентаций волокон и создания линий тока. Эти трехмерные реконструкции графически изображают пути между начальной областью или исходной областью (аналогично месту инъекции) и целевой областью, производя пути волокон на большие расстояния.В конце тракта ослабленный сигнал приводит к потере надежной локальной ориентации волокна, обнаруживаемой картами STA. Это приводит к внезапным изменениям ориентации волокна и резким поворотам линий тока, которые превышают типичные пороги кривизны, что приводит к прекращению отслеживания.

Мы использовали координаты участков и инструменты картографии, реализованные в программном обеспечении Mrtrix3 (http://www.mrtrix.org). Кроме того, мы использовали деформированные метки ARA на основе преобразования CLARITY-ARA для вычисления терминальных зон по анатомическим меткам средней онтологии из инъекций mPFC.Эти метки были созданы на среднем уровне онтологии, чтобы сосредоточить внимание на структурах деталей в анализе связности. Затем результаты оптимизации трактографии были отфильтрованы по основным лейблам, участвующим в сети mPFC, на основе карт плотности трактов из нашего предыдущего анализа, например, ABC, VTA и ACA. Для каждой метки были вычислены два набора линий тока с использованием ее в качестве маски включения, идентифицирующей как (а) волокна, проходящие через структуру, и (б) волокна, оканчивающиеся внутри структуры. Чтобы подчеркнуть различия в вычислительной связности, основанной на двух подходах (проходящем и оконечном волокнах), мы суммировали результаты подключения в виде графов вычислительной сети (рис.6, дополнительный рис.11). Обобщенные данные из карт плотности трактов и терминалов трактов (т. Е. Количества терминалов) на метки ARA были обработаны пороговым значением по силе соединения и преобразованы в матрицы подключения для визуализации. Значения связности на картах терминалов были масштабированы для сопоставимого визуального представления с картой плотности тракта. Мы использовали сетевые графы из клиента Python инфраструктуры визуализации Lightning (http://lightning-viz.org/). Данные эксперимента по инъекции PL дикого типа графа связности Аллена были извлечены и сравнены с нашими сетевыми графиками CLARITY.Карта плотности проекции была суммирована по меткам, пороговым значением в зависимости от силы соединения и преобразована в матрицу связности для визуализации. Используемая структура позволяет создавать интерактивные веб-визуализации (дополнительный рис. 11).

dMRI трактография и сравнение с подключением Allen

Чтобы деформировать метки ARA для посева трактографии и анализа связности, структурная ex vivo T1 FLASH с высоким разрешением была зарегистрирована на 25 мкм шаблоне ARA с использованием модуля регистрации MRI-Allen прибора конвейер (описанный выше в разделе «Регистрация изображений ЧЕТКОСТЬ всего мозга в ARA»).Шаг деформируемой регистрации между структурной МРТ и S0 (изотропным) диффузным изображением был выполнен с использованием ANT ³³ . Поля деформации из обеих регистраций были использованы для деформации меток ARA в диффузионное пространство ex vivo за один шаг. Затем PL был установлен порог для использования в качестве затравки для всех следующих экспериментов DTI. Необработанные данные диффузии сначала были скорректированы на вихревые искажения путем регистрации каждого направления диффузии на изображении b0 с помощью инструмента eddy ⁶² из пакета анализа изображений FSL (https: // www.fmrib.ox.ac.uk/fsl). Затем были вычислены тензоры диффузии из стандартной модели диффузии. Для методов на основе CSD оценивалась функция отклика, а затем использовалось ядро ​​для вычисления FOD на воксель. Мы провели три эксперимента по трактографии, каждый с различным алгоритмом отслеживания, используя MRtrix3 (http://www.mrtrix.org). Количество выходных линий тока было установлено на 500 000 для всех экспериментов. Первым использованным алгоритмом отслеживания был FACT ⁵⁰ , детерминированный подход, основанный на тензорах диффузии и главных собственных векторах.Мы выбрали порог остановки FA, равный 0,2, максимальный угол между ступенями 25 градусов и размер шага 0,01. Вторым методом был SDstream ⁴⁵ , детерминированный алгоритм на основе CSD, который использует информацию FOD для трактографии. Было выбрано ограничение амплитуды FOD 0,2. В последнем эксперименте с отслеживанием использовался вероятностный алгоритм ( iFOD2 ), который интегрируется по FOD для вычисления линий тока волокна ⁴⁵ , для которого мы использовали отсечку FOD, равную 0.2. Чтобы вычислить изображение плотности проекции из линий тока трактографии, визуализация плотности тракта (TDI) использовалась для создания карты, где каждое значение вокселя соответствует количеству линий тока, проходящих через воксель ⁶³ . Изображение плотности тракта было создано для результатов вероятностной трактографии (метод iFOD ) на сетке с более высоким разрешением (25 мкм), чтобы соответствовать разрешению ARA.

Чтобы сравнить нашу диффузионную трактографию с атласом связности Аллена, карта TDI была преобразована в пространство ARA с использованием преобразований и полей деформации диффузии для регистрации ARA, выполненной ранее.Затем мы использовали API подключения Allen Brain Institute для запроса и загрузки изображения плотности проекции эксперимента с PL в качестве места инъекции. Был выбран эксперимент с наивысшим объемом метки в месте инъекции (0,14 мм ³ ) для линии мышей C57BL / 6J дикого типа (опыт № 157711748). Инъекция имела перекрытие 53% с PL и 42% с инфралимбической областью, что соответствует аналогичным инъекциям в наших экспериментах по отслеживанию вирусов CLARITY. Чтобы автоматизировать эту процедуру, мы добавили функцию в представленный конвейер, посредством которой пользователь указывает желаемое место инъекции (метку), а сценарий выводит изображение плотности проекции, связанные метки (по идентификатору и аббревиатуре) и карту проекции (аналогично к представленным на рис.5) для этого эксперимента с инъекцией.

Краткое изложение отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Резюме отчета об исследовании природы, связанном с этой статьей.

Регистрация изображений — обзор

VIII.B Регистрация изображений

Прежде чем мы сможем сопоставить два или более изображений, их, возможно, придется выровнять для компенсации различных точек обзора или времени получения. Например, если мы хотим объединить информацию из изображений КТ, рентгеновских лучей и МРТ, они должны быть зарегистрированы в общей системе координат, прежде чем можно будет попытаться слияние или обнаружение изменений.Подобные ситуации возникают в приложениях для использования изображений и автоматического распознавания целей. Также существуют ситуации, когда вместо того, чтобы связывать несколько изображений друг с другом, нужно зарегистрировать несколько изображений, полученных в разное время, в трехмерной модели. Эти методы называются методами позиционирования, поддерживаемыми моделью. Большинство традиционных методов регистрации изображений, основанных на корреляции областей или сопоставлении признаков, могут обрабатывать только незначительные геометрические и фотометрические отклонения (обычно в изображениях, собранных одним и тем же датчиком).Однако в контексте мультисенсора регистрируемые изображения могут быть самых разных типов, полученных разными сенсорами с разным разрешением, уровнями шума и геометрией изображения. Общая или «взаимная» информация, лежащая в основе автоматической регистрации изображений, может проявляться в каждом изображении по-разному. Это связано с тем, что разные датчики регистрируют различные физические явления в сцене. Например, инфракрасный датчик реагирует на распределение температуры сцены, тогда как радар реагирует на свойства материала, такие как диэлектрическая постоянная, электрическая проводимость и шероховатость поверхности.

Поскольку нижележащая сцена, порождающая совместно используемую информацию, такая же, как и все изображения сцены, можно сделать определенные качественные утверждения о том, каким образом информация сохраняется в мультисенсорных данных. Хотя пиксели, соответствующие одной и той же области сцены, могут иметь разные значения в зависимости от датчика, сходство пикселей и несходство пикселей обычно сохраняется. Другими словами, область, которая кажется однородной для одного сенсора, скорее всего, будет казаться однородной для другого, если не считать местных текстурных вариаций.Области, которые можно четко отличить друг от друга на одном изображении, вероятно, будут отличаться друг от друга на других изображениях, независимо от используемого датчика. Хотя это верно не во всех случаях, в целом это справедливо для большинства типов датчиков и сцен. Искусственные объекты, такие как здания и дороги на аэрофотоснимках, а также имплантаты, протезы и металлические зонды на медицинских изображениях, также создают особенности, которые, вероятно, сохранятся на мультисенсорных изображениях. Поэтому методы на основе признаков, которые используют информацию, содержащуюся в границах регионов и в искусственных структурах, полезны для мультисенсорной регистрации.

Методы, основанные на признаках, традиционно основываются на установлении соответствия признаков между двумя изображениями. В таких основанных на соответствии методах сначала используются методы сопоставления признаков для определения соответствующих пар признаков на двух изображениях, а затем вычисляется геометрическое преобразование, связывающее их, обычно с использованием метода наименьших квадратов. Их основное преимущество состоит в том, что параметры преобразования могут быть вычислены за один шаг и являются точными, если сопоставление признаков надежно.Их недостатком является то, что они требуют сопоставления признаков, что трудно выполнить в контексте мультисенсора и требует больших вычислительных затрат, если только два изображения уже не зарегистрированы приблизительно или количество признаков невелико.

Были предложены некоторые методы регистрации без соответствия, основанные на моментах признаков изображения, но эти методы, хотя и математически элегантны, работают только в том случае, если два изображения содержат точно такой же набор признаков. Это требование редко выполняется в реальных изображениях.Другой предлагаемый класс методов основан на обобщенном преобразовании Хафа (GHT). Эти методы отображают пространство признаков в пространство параметров, позволяя каждой паре признаков голосовать за подпространство пространства параметров. Затем кластеры голосов в пространстве параметров используются для оценки значений параметров. Эти методы, хотя и гораздо более надежные и практичные, чем методы, основанные на моментах, имеют некоторые ограничения. Методы, основанные на GHT, имеют тенденцию давать большое количество ложных срабатываний. Они также имеют тенденцию быть дорогостоящими в вычислительном отношении, поскольку размерность задачи равна количеству параметров преобразования.

Недавно были предложены методы, похожие по духу на методы в стиле GHT, но использующие другую стратегию поиска для устранения связанных с ними проблем. Эти методы сначала разбивают исходное преобразование на последовательность элементарных этапов. На каждом этапе значение одного параметра преобразования оценивается с помощью механизма консенсуса по признакам, в котором каждой паре признаков разрешается оценивать значение параметра, который с ней согласуется. Значение параметра, которое согласуется с большинством пар признаков, считается его наилучшей оценкой.Используя концепции наблюдаемости параметров и разделимости параметров, в большинстве случаев можно избежать необходимости сочетания признаков; вместо этого используются совокупные свойства функций, определенные для каждого изображения отдельно.